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人造血小板离我们还有多远

发布时间:2019-01-22

                    人造血小板离我们还有多远

 

    日前,顶级生命科学期刊《Cell》发表了日本京都大学iPS细胞研究与应用中心Ito等人的研究“湍流激活血小板的生物发生使其体外制备达到临床应用规模”(Turbulence Activates Platelet Biogenesis to Enable Clinical Scale Ex Vivo Production),引起输血业界的高度关注。这项研究显示人造血小板,准确地说,是使用诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem celliPSC)制备血小板的“生产效率”初步达到了临床实际应用的水平,这意味着,人造血小板开始从“实验台来到病床边”。

    一、人造血小板——现在和将来的巨大需求

    血小板的直径约2μm,形状不规则,在血液中的数量约为100-300×109/L。血小板的功能是止血和加速凝血,其数量不足或功能缺陷可引起严重的出血,如白血病、恶性肿瘤化疗、再生障碍性贫血等。这些疾病都可能需要输注血小板治疗。

    一般我们说血液中的细胞成分主要有红细胞、白细胞和血小板——好像最近有个卡通很流行,让这几种血液“工作细胞”有成为“网红”的趋势。但严格来说,这三种成分完全不一样,白细胞是完整意义上的细胞:有包含遗传信息的细胞核和复杂的细胞器;红细胞是高度特化的类细胞形态,为了高效地完成输送氧的职能,已放弃了细胞核;血小板则只是细胞的碎片——巨核细胞局部裂解形成的小块胞质。

    根据WHO的统计(2013年数据),高收入国家(人均国民收入12000美元以上)每千人口输注血小板3.54单位(中位数);中高收入国家(4000-12000美元)0.87单位;中低与低收入国家(1000-4000美元和1000美元以下)0.02单位。可以看出,对血小板的需求跟经济社会发展水平正相关。我国(8250美元)正在从中高收入国家快速迈向高收入国家行列,按照前述水平计算,目前需要血小板约121.8万单位/年;在不久的将来(2025年前后)可能需要495.6万单位/年。而我国2016年血小板临床供应总量是184.8万单位。可以看出,我国的临床血小板供应将面临越来越大的压力,在人口老龄化日益严重的情况下更是如此。

     二、人造血小板的来源——不死的iPSC

 如果血小板能人工制造,临床需求与供应的矛盾自然就迎刃而解。那么制造血小板的“原料”从何而来呢?前面说过,血小板来自于巨核细胞的胞质碎片,巨核细胞则来自于造血干细胞的分化。但造血干细胞的获得较难(可以了解一下造血干细胞捐献),体外培养不易,很难扩增。因此,研究者们纷纷把目光转向近十年来的研究热点——iPSC

2007年,日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)和美国科学家Thompson分别成功地将人成纤维细胞“改造”(重编程)成多能干细胞。也就是说,使已经分化成熟的细胞发生“跃迁”,回到较原始的状态,重新获得了分化成不同成熟细胞的功能。

iPSC一经诞生便成为生命科学领域的超级明星,成为再生医学研究热点。从iPSC可以分化得到血小板的祖先细胞——巨核细胞(MegakaraocyteMK)。目前,研究人员已经建立了永生的巨核细胞系,可源源不断地提供血小板的“母体”(Matrix)。

iPSC临床应用的最大阻碍之一,就是经iPS细胞分化产生的成熟细胞中还混杂着原始iPSC,从而有远期致瘤的风险。然而,这一阻碍在血小板的制造中却并不是大问题,因为人们可以用辐照的方法清除人造血小板中的原始细胞。那么血小板难道不怕辐照么?没错,因为血小板是无核的,或者说,它并非真正的活细胞,所以不怕辐照。

使用iPSC可制备出永生的细胞系,持续提供血小板的来源,其增值潜能不受Hayflick限制的约束(Hayflick限制指的是体外培养的细胞在分裂复制50-70次以后,由于端粒的丢失缩短而逐渐失去增殖能力)。iPSC制备血小板的另一个优势是可以对血小板进行“基因改造”。比如有研究者将iPSC来源的MK的β2-微球蛋白基因敲除,使其不再表达人主要组织相容性抗原HLA,从而产生了“万能血小板”。

 三、人造血小板的生产——蚕茧中的生物工厂

 有了人造血小板的原料——来自iPSCMK细胞系,那么具体如何制造了血小板呢?最有效的是模拟人体骨髓血小板造血的生理过程,这需要对血小板的生理发生过程进行直接、实时的观察,了解细胞和分子层面的微观生命活动。而近年来活体显微成像技术解决了这一难题。通过对骨髓造血的直接观察,人们了解了血小板生理发生的细节。

在巨核细胞迁移至血管壁的内皮细胞层后,巨核细胞的胞质突起(血小板前体)从内皮细胞间隙伸入血管腔,在血流的冲击(剪切力)下,胞质突起脱落、裂解形成血小板。如下图所示:

    根据以上研究,人们认为,在血小板的生理产生过程中起作用的因素主要包括:

血管,一个中空的管道,血流通过并产生剪切应力;

血管壁的内皮细胞层,提供一个具有硬度的交界面;

细胞因子(Cytokine),趋化作用,使巨核细胞聚集于血管内皮细胞层外;

细胞外基质成分(ECM),支持巨核细胞的发育;

巨核细胞(MK),血小板的母体细胞。

    于是,研究者用人工材料(丝织海绵)做成了包含上述条件的血小板造血3D仿生构造,看起来很像一个蚕茧中的生物工厂。

 四、人造血小板的数量与效率——湍流的秘密

解决人造血小板的另一个关键问题是生产效率。实际上,人造红细胞正是因为效率源不能满足临床输注需求,离实际应用仍然遥远。人造血小板也始终面临这一难题。即使应用了上述的各种条件,如剪切应力、各种可溶性因子、细胞外基质及其硬度等,生物制备的血小板数量离实际临床应用的要求仍然存在很大差距。

临床上一个治疗量的单采血小板约含2-3×1011个血小板,也就是2000-3000亿个血小板。在人体生理造血过程中,骨髓造血干细胞产生的每个MK可生成超过2000个血小板,而在之前少数几个“大规模”制备人造血小板的研究中,每个iPSC平均可产生16MK,而每个MK可产生约30个血小板。不难看出,iPSC制备血小板的效率远不如正常的人体骨髓造血。

在前人研究的基础上,Ito等开发了各种不同的微流体血小板生物发生器。他们发现,湍流可以刺激培养中的MK分泌一些可溶性因子,包括胰岛素因子结合蛋白2IGFBP)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)和苯乙肼裂解酶(NRDC),这些因子促进体外培养中血小板的脱落,从而大大提高了体外血小板制备的数量。研究者依次使用0.3L2.4L8L容量的生物反应器,最终成功制备了1-1.3×1011个血小板,并且在体外和体内实验中都显示了类似于捐献血小板的正常功能。

这一研究首次将体外制备的血小板数量达到了实际临床应用水平,具有里程碑式的意义。正想本文开始所说,人造血小板终于可能从实验室走到病房。

五、前景美好——但挑战依然存在

iPSC制备血小板的研究成果显示了光明的应用前景,为人造血液的研究注射了一支强心针。或许在不久的将来,人造血液将大大缓解日趋紧张的血小板供应压力。

 但是,挑战依然存在。

 首先,与“天然”的捐献血小板相比,iPSC制备的血小板的大小、形态、活性和体外存活时间存在高度不均一性,尚不符合目前高度标准化的血小板制品管理及临床应用要求;

 其次,iPSC制备血小板的整个过程需要26天,难以解决临床紧急用血需求;

最后,iPSC制备血小板的成本可能要远高于捐献血小板,这也是一个不容忽视的问题。

现阶段,为了满足临床病患的用血需求,最最重要的仍然是:

 无偿献血,定期献血。