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PCR过程的内源性与外源性内标

发布时间:2022-06-14



常规荧光定量PCR的流程是:样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录(RNA病毒)-扩增-结果读取。但是因为标本采集、核酸提取和PCR反应过程等多个过程都有存在假阴性的可能,所以为了更好的避免这种情况,核酸检测试剂往往会设计内对照,也就是我们常说的—内标。



内标是指在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式,一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标,另一种是人工添加的内标。内标的最大特点是与靶序列共同扩增,如果内对照无扩增曲线,则提示实验环节存在问题,该标本实验无效。



内对照分为两类:内源性内标和外源性内标



一、内源性内标



内源性内标,通常它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。内参基因通常是持家基因(house-keeping gene)因为其表达水平受环境因素影响较小,而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)18sRNAB2MHPRTTBP等。



这些基因在人体各器官组织细胞中普遍存在,存在于采集的咽拭子等标本中,因此可以检测是否采集到了上皮细胞及整个实验操作过程的准确性,由于人基因组和病毒提取效率存在一定差别,内源性内标无法完全监测提取过程中存在的问题。



优势:



与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序,可以监控采样,运输,核酸提取和扩增的全部过程,既可以监测是否采集到的足够量的样本细胞,又可以监测提取和扩增检测过程。



劣势:



不同物种,不同生理状态下,不同组织中的内参基因存在一定的差异,同时人基因组和病毒提取效率存在一定差别,如果样品类型是口腔液,咽拭子等样品,内参基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。



二、外源性内标



外源性内标又可以分为两种,一种是国外常用的添加一种不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标,直接添加在反应液中与模板一起扩增,能监测扩增过程。另一种是使用人工合成的假病毒,在核酸提取前在每一份样品中加入等量的内标,这样就可以监控样品的提取到扩增的过程。



常用的是MS2噬菌体等假病毒,在临床标本制备前加入,然后与标本中的靶核酸一起经历核酸提取过程,可以较全面地监测从核酸提取到产物分析全过程的有效性。外源性内标不但可以监测标本中PCR抑制物及核酸提取中试剂的混入所致的假阴性外,而且还可以监测因为PCR扩增仪孔位间温度的不准确及核酸的提取效率太低所致的假阴性。



优势:



能更好的反映核酸提取及扩增检测过程(外源性内标的假病毒与真实病毒模板在基因序列上相近,因此扩增效率相近)。是对临床样本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施。



劣势:



不能监测是否采集到足量的细胞样本,存在竞争抑制的可能。但是这样的内标不能监控采样,运输和核酸提取的过程,不能监控胞内细菌病毒的释放情况。



从上文可知没有一种对照是完美的,在检测中我们要根据自己的需求来进行灵活选择和搭配。建议每一次检测时添加一个能对从提取到扩增环节进行监控的质控品或标准物质;每份检测样品中添加内标(如果样品种类比较多样建议使用人工内标,如果样品类型为相对固定的动物组织建议使用内参基因)



内标设置是为了避免“假阴性”的出现,监控整个反应过程是否顺利进行,无论内源性内标还是外源性内标都可以满足。

















(文章来源于IVD工具人公众号)