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PCR实验室防污染措施及应急处理方法

发布时间:2021-12-23



PCR实验室防污染措施及应急处理方法



PCR实验室的污染来源



1、样本间交叉污染:



收集样本的容器被污染或样本密封不严外溢;不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖;移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌;不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散,相互交叉污染。



2、实验试剂污染:



主要是在
PCR
组分试剂加样过程中,由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。
 加样过程中,因为 PCR 试剂对温度十分敏感,需要通过冰浴使得 PCR 试剂和 PCR /管处于 0℃,但这个过程也是充满了污染的风险的。



3、扩增产物污染:



大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖,这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 产物拷贝量大,远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的 PCR 产物污染,就可形成假阳性。



4、克隆质粒污染:



作为阳性质控品的克隆质粒外溢。



PCR实验室的防污染方法



按照实验室的安全工作制度或安全标准操作程序,所有操作符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。



1、严格执行各区功能划分:



试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。



标本制备区:核酸(RNADNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。



扩增区:cDNA合成、DNA扩增及检测。



扩增产物分析区:扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。



试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品,包括移液器等器具应专用,空气、物品流向依次为:试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区,不可逆行。



2、清洁的实验用品:



实验室自配试剂(去离子水、缓冲液等)和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。



3、正确的实验操作:



实验应在超净工作台内进行,工作台内应放置PCR专用的微量离心机、各量程的移液器和其他必须物品。



实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换,在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套,以避免不同实验区交叉污染。



装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心,将管壁及管盖上的液体离至管底,降低污染手套或加样器的风险;谨慎开启反应管,防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。



吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行,遵守“慢吸快打”原则,尽量一次性完成,忌多次抽吸,以避免气溶胶产生的交叉污染。



PCR试剂建议小量分装,以减少反复冻融、重复取样次数;多样本PCR反应时,先配制反应混合液分装至反应管中,最后加入样本核酸,请勿同时开盖,尽量保证单人单管,实现完全闭管操作。



实验试剂应与样品和PCR产物分开保存,不应放于同处。



PCR扩增实验完成后及时将反应管取出,用一次性手套将产物反应管包裹丢弃,保证管盖紧闭。



4、规范的实验设计:



应遵循实验室内部质量控制的相关规定,实验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照,全程质控实验过程,验证PCR反应的可靠性,并协助判断扩增系统的可信性。



PCR实验室的污染应急处理方法



1、若核酸样本溢出:



立即用布或纸巾覆盖,由外围向中心倾倒10%的次氯酸消毒剂,约30分钟后,清除污染物品,再用次氯酸消毒剂擦拭,并用75%酒精喷洒,移动紫外车定点照射1小时。



2、其他不明情况污染:



1、暂停所有实验操作;



2、清理实验室内所有物品,寻找污染来源;



3、加大实验室的通风;



4、对实验室内所有表面(台面、地面及墙面) 进行消毒;



575%酒精空中喷雾;



6、开启紫外消毒装置,延长紫外照射时间(4小时以上);



7、以上措施每日进行,直至污染消除;用新试剂及确认无污染的器材进行原污染项目的试剂空白检测,连续3次均阴性后方可进行常规检测。