细菌检验工作的基本技术——链球菌属

链球菌属

一、常规鉴定

(一)属间鉴别

临床标本检到革兰阳性球菌、触酶阴性，除链球菌属外，尚有6个菌属，是：

肠球菌属    Enterococcus

乳球菌属    Lactococcus

无色藻菌属  Leuconostoc

平面球菌属  Pediococcus

孪生球菌属  Gemella

气球菌属    Aerococcus

在鉴别上述菌属时，关键是：①革兰染色。上述菌属的革兰染色特性相似，若从琼脂平板上涂片染色，无色藻菌属中某些菌种的形态呈现球杆形、杆形，容易与乳杆菌属菌种相混淆，后者触酶亦阴性。若生长在盐肉汤涂片，最容易出现不一致性。②触酶试验。目的是与葡萄球菌属和口腔球菌属鉴别。属间鉴别参见下表。

表              触酶阴性或弱阳性的革兰阳性球菌的鉴别特征

注：a．S，敏感；R，耐药；+，阳性反应；一，阴性反应；V，反应不定(有些菌株+，另外菌株-)

b．化脓链球菌和L-garviae可阳性。

c．偶尔例外。

(二)属内鉴别

链球菌属内鉴别，首先观察在血液琼脂平板上的溶血环，是β溶血型，或非β溶血型，参照这二类溶血型菌种的鉴别。

1．β溶血链球菌的鉴定：β溶血型链球菌的鉴定都是检测特异多糖抗原称为链球菌群多糖抗原来分群，可采用商业性试剂盒，当前血清学诊断方法尚未普及之前，传统的对β溶血链球菌的鉴别仍是需要的。

A、B、D、G群细菌，一般可用杆菌肽、CAMP、胆汁七叶苷及PYR、VP等试验区别 (见表)。

表                      β溶血链球菌的鉴别特征

注：a．+，阳性；一，阴性；d，不同菌株。

  b．有人认为咽峡炎链球菌与米勒链球菌是同义词。

2．非β溶血链球菌鉴别

肺炎链球菌的鉴定：生长在血琼脂平板上的菌落细小，圆形，表面光滑、灰白色、边缘整齐，半透明，开始扁平以后中心塌陷，呈脐窝状。菌体呈矛头状成双排列。该菌对Optochin敏感和胆汁溶菌试验阳性。

3．牛链球菌的鉴定：具有D群多糖抗原，6.5％NaCl不生长，PYR阴性，胆汁七叶苷阳性，与其他草绿色链球菌鉴别见下表。

表                     非β溶血型链球菌的鉴别

注：a. +，阳性反应；-，阴性反应；土，有些菌株阳性，另外菌株阴性。

b. 偶见例外。

营养变异链球菌是草绿色链球菌的营养变种，在普通肉汤或琼脂平板上生长不良(通常发现在血液培养瓶中)。若培养基中加入吡哆醛或做“卫星现象”试验容易被发现，有二个种，即缺陷链球菌S．defectivus，毗邻链球菌S.adjacens。

草绿色链球菌的鉴定：革兰阳性球菌，触酶阴性，非β溶血、胆汁溶菌阴性，Optochin阴性，不存在B、D群抗原，6.5％NaCl肉汤不生长，PYR阴性，10℃，45℃不生长，胆汁七叶苷阴性，万古霉素敏感。该类链球菌种较多，目前临床仅鉴定到群，参见下表。

表                 草绿色链球菌的鉴定

注： a．+，阳性反应；一，阴性反应；土，有些菌株阳性而另外菌株阴性。

b．偶见例外。

c．变异链球菌群包括：仓鼠、道尼、野鼠，猕猴、鼠亲缘链球菌，唾液链球菌群包括：肠、前腔链球菌，血液链球菌群包括：戈登、H．W群链球菌，缓症链球菌群包括：温和、口腔、血链球菌生物'型链球菌，咽峡炎链球菌群包括：中间、星座、米勒链球菌。

咽峡炎链球菌是未分群的链球菌，被认为是“米勒链球菌”的同义词，有β溶血的菌种，属于A、C、F、G群，也有非β溶血菌种，在A、C、G群链球菌中有小菌落型菌株。非β溶血，带有相同的Lancefield抗原，属于草绿色链球菌(“米勒”群)细菌，有3个种；米勒链球菌、中间链球菌、星座链球菌。

(三)与链球菌属相关菌属的描述

1．乳球菌属：原链球菌属中乳链球菌现成为乳球菌属。乳球菌和乳脂乳球菌在制酪和粮食工业生产中使用。临床标本中也常见到。该属菌种与肠球菌相似，唯一不同点是45℃不生长。

2．孪生球菌属：原麻疹链球菌现转入孪生球菌属，另一种是溶血孪生球菌。该属菌种曾从临床标本中检到，见于临床感染如心内膜炎。其特点是生长缓慢，可能被误认为营养缺陷链球菌，应用“卫星现象”试验区别开来。菌种鉴定，参照下表所示。

表                      孪生球菌属菌种鉴定

注：+，阳性；一，阴性；+’，弱阳性反应。

3．平面球菌属：该属菌种对万古霉素耐药，PYR阴性，发酵葡萄糖不产气，胆汁七叶苷、精氨酸阳性，含有D群抗原，不发酵乳糖，在含盐肉汤中生长缓慢，属内鉴别参见下表。乳酸平面球菌和戊糖平面球菌曾从临床标本中分离到。

表                        平面球菌属菌种鉴定

注：+，阳性，一，阴性。

  4．无色藻菌属：该属菌种万古霉素耐药，PYR、LAP阴性，发酵葡萄糖(MRS肉汤)产气，有4个菌种曾从临床标本中检到，种间鉴别参照下表。

表                         无色藻菌属菌种鉴定

注：a.+，阳性；-，阴性；?，不了解；5％蔗糖，菌细胞外产生多糖(粘质物)

二、试验方法

(一)溶血性检查

溶血性是鉴定球菌最常用的项目，也是鉴定过程中重要的一步。1919年Brown对溶血性进行了描述。

α溶血：或称甲型溶血，在血平板上，菌落周围部分红细胞被破坏，呈现一个草绿色环。

β溶血：或称乙型溶血，在血平板上，菌落周围红细胞完全溶解，呈现一个清楚透明溶血环。

γ溶血：或称丙型溶血，血平板上，菌落周围无红细胞溶解，因而无溶血环。

溶血性的识别可在血平板表面菌落周围和穿刺处通过肉眼观察，也可用显微镜观察。除在分离血平板上观察菌落周围的溶血性外，还可用以下方法确认。

材料：羊血平板。

方法：将标本接种于羊血平板上，用接种针在已接种过的血平板上扎2～3处，使细菌被接种到琼脂层深处，35℃孵育过夜。

观察结果：在接种针穿刺过处，羊红细胞完全溶解，形成无色透明区，为β溶血。羊红细胞部分溶解或不溶解呈草绿色的环，为α溶血。不溶解无溶血环为γ溶血。

(二) Optochin敏感试验

材料：Optochin  (ethylhydrocupreine HCI。)纸片(直径6mm)，每片含5μg。血平板。

方法：挑取被检菌落，涂在血平板上，贴 Optochin纸片于接种处，35℃，烛缸孵育18h。

观察结果：抑菌环直径≥14mm为敏感，推断肺炎链球菌。

抑菌环直径≤14mm时参照胆汁溶菌，或为其他草绿色链球菌。

(三) 杆菌肽敏感试验

材料：含0.04U／片的杆菌肽纸片，血平板。

方法：挑取被检菌落，密涂于血平板上，接种量应大，以免出假阳性。贴上杆菌肽纸片，35℃过夜。

观察结果：形成抑菌环为敏感，则被检菌推断为A群链球菌。

(四) CAMP试验

材料：血平板，金黄色葡萄球菌 ATCC25923。

方法：在血平板上，用金黄色葡萄球菌划种一条直线，再将被检菌距金黄色葡萄球菌 3mm处垂直接种一短线。用同样方法接种阴性和阳性对照菌。35℃孵育过夜。

观察结果：在被检菌接种线与金葡菌接种线之间有一个矢形(半月形)加强溶血区，此即CAMP试验阳性。阴性无加强溶血区。

(五) 胆汁-七叶苷试验(平皿法或斜面法)

培养基：      

牛肉膏          3g

七叶苷          1g

蛋白胨          5g

枸橼酸铁              0.5g

胆盐                  40g

蒸馏水       1000ml

琼脂                  1％

牛肉膏、蛋白胨和琼脂溶于400ml蒸馏水中，胆盐溶于400ml蒸馏水中，枸橼酸铁溶于l00ml蒸馏水中，三者混合，加热充分溶解后，高压灭菌121℃ 15min。七叶苷溶于l00ml蒸馏水，过滤除菌，以无菌手续加到培养基中，倾倒平皿或斜面。

方法：接种被检菌1—3个菌落，涂划开，置35℃下，孵育24～48h。

观察结果：培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。

注意事项：接种细菌量不能过大。本试验是测定细菌在胆盐中生长情况及同时分解七叶苷的能力，如接种菌量过大，细菌不需要生长而本身固有的酶足以造成七叶苷分解，出现假阳性结果。

(六)七叶苷试验

培养基：

蛋白胨        5g

七叶苷        3g

K₂HPO₄       1g

枸橼酸铁           0.5g

蒸馏水        1000ml

将上述成分加热溶解，分装试管，高压灭菌12rClomin。

方法：接种被检菌于培养基中，35℃过夜。

观察结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。

(七) 6.5％NaCl生长试验

培养基

NaCl              6.5g

牛肉粉          0.3g

葡萄糖          0.1g

蛋白胨          1g

琼脂粉       1.8g

蒸馏水       l00ml

溴甲酚紫指示剂适量

调整pH7.4，121℃ 15min灭菌后制成平皿或斜面。

方法：接种被检菌，35℃孵育过夜。

观察结果：培养基上生长出菌落并变黄色为阳性，不变色为阴性。

注意点：本试验是测定细菌在高盐中的生长能力，葡萄糖作为是否生长的指示剂。细菌接种量不能过大，否则细菌并不需要繁殖即可使葡萄糖产酸，培养基变色，导致假阳性结果。

(八) 色素试验

色素试验在鉴定B群链球菌的几个方法中，特异性最好。这是Noble改良的Islam法。

培养基：

淀粉                     10g

胨                  23.0g

NaH₂PO₄                1.48g

Na₂HP0₄                 5.75g

琼脂                  l0g

水               1000ml

调pH7.4，121℃15min灭菌后，加入 10ml灭活马血清，倾制平板或高层琼脂。接种细菌，35℃过夜培养。

观察结果：细菌菌落及周围的培养基呈黄色为阳性。