血液质控人造血小板离我们还有多远
日前，顶级生命科学期刊《Cell》发表了日本京都大学iPS细胞研究与应用中心Ito等人的研究“湍流激活血小板的生物发生使其体外制备达到临床应用规模”（Turbulence Activates Platelet Biogenesis to Enable Clinical Scale Ex Vivo Production），引起输血业界的高度关注。这项研究显示人造血小板，准确地说，是使用诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）制备血小板的“生产效率”初步达到了临床实际应用的水平，这意味着，人造血小板开始从“实验台来到病床边”。
一、人造血小板——现在和将来的巨大需求
血小板的直径约2μm，形状不规则，在血液中的数量约为100-300×109/L。血小板的功能是止血和加速凝血，其数量不足或功能缺陷可引起严重的出血，如白血病、恶性肿瘤化疗、再生障碍性贫血等。这些疾病都可能需要输注血小板治疗。
一般我们说血液中的细胞成分主要有红细胞、白细胞和血小板——好像最近有个卡通很流行，让这几种血液“工作细胞”有成为“网红”的趋势。但严格来说，这三种成分完全不一样，白细胞是完整意义上的细胞：有包含遗传信息的细胞核和复杂的细胞器；红细胞是高度特化的类细胞形态，为了高效地完成输送氧的职能，已放弃了细胞核；血小板则只是细胞的碎片——巨核细胞局部裂解形成的小块胞质。
根据WHO的统计（2013年数据），高收入国家（人均国民收入12000美元以上）每千人口输注血小板3.54单位（中位数）；中高收入国家（4000-12000美元）0.87单位；中低与低收入国家（1000-4000美元和1000美元以下）0.02单位。可以看出，对血小板的需求跟经济社会发展水平正相关。我国（8250美元）正在从中高收入国家快速迈向高收入国家行列，按照前述水平计算，目前需要血小板约121.8万单位/年；在不久的将来（2025年前后）可能需要495.6万单位/年。而我国2016年血小板临床供应总量是184.8万单位。可以看出，我国的临床血小板供应将面临越来越大的压力，在人口老龄化日益严重的情况下更是如此。
二、人造血小板的来源——不死的iPSC
如果血小板能人工制造，临床需求与供应的矛盾自然就迎刃而解。那么制造血小板的“原料”从何而来呢？前面说过，血小板来自于巨核细胞的胞质碎片，巨核细胞则来自于造血干细胞的分化。但造血干细胞的获得较难（可以了解一下造血干细胞捐献），体外培养不易，很难扩增。因此，研究者们纷纷把目光转向近十年来的研究热点——iPSC。
2007年，日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）和美国科学家Thompson分别成功地将人成纤维细胞“改造”（重编程）成多能干细胞。也就是说，使已经分化成熟的细胞发生“跃迁”，回到较原始的状态，重新获得了分化成不同成熟细胞的功能。
iPSC一经诞生便成为生命科学领域的超级明星，成为再生医学研究热点。从iPSC可以分化得到血小板的祖先细胞——巨核细胞（Megakaraocyte，MK）。目前，研究人员已经建立了永生的巨核细胞系，可源源不断地提供血小板的“母体”（Matrix）。
iPSC临床应用的最大阻碍之一，就是经iPS细胞分化产生的成熟细胞中还混杂着原始iPSC，从而有远期致瘤的风险。然而，这一阻碍在血小板的制造中却并不是大问题，因为人们可以用辐照的方法清除人造血小板中的原始细胞。那么血小板难道不怕辐照么？没错，因为血小板是无核的，或者说，它并非真正的活细胞，所以不怕辐照。
使用iPSC可制备出永生的细胞系，持续提供血小板的来源，其增值潜能不受Hayflick限制的约束（Hayflick限制指的是体外培养的细胞在分裂复制50-70次以后，由于端粒的丢失缩短而逐渐失去增殖能力）。iPSC制备血小板的另一个优势是可以对血小板进行“基因改造”。比如有研究者将iPSC来源的MK的β2-微球蛋白基因敲除，使其不再表达人主要组织相容性抗原HLA，从而产生了“万能血小板”。
三、人造血小板的生产——蚕茧中的生物工厂
有了人造血小板的原料——来自iPSC的MK细胞系，那么具体如何制造了血小板呢？最有效的是模拟人体骨髓血小板造血的生理过程，这需要对血小板的生理发生过程进行直接、实时的观察，了解细胞和分子层面的微观生命活动。而近年来活体显微成像技术解决了这一难题。通过对骨髓造血的直接观察，人们了解了血小板生理发生的细节。
在巨核细胞迁移至血管壁的内皮细胞层后，巨核细胞的胞质突起（血小板前体）从内皮细胞间隙伸入血管腔，在血流的冲击（剪切力）下，胞质突起脱落、裂解形成血小板。如下图所示：
根据以上研究，人们认为，在血小板的生理产生过程中起作用的因素主要包括：
血管，一个中空的管道，血流通过并产生剪切应力；
血管壁的内皮细胞层，提供一个具有硬度的交界面；
细胞因子（Cytokine），趋化作用，使巨核细胞聚集于血管内皮细胞层外；
细胞外基质成分（ECM），支持巨核细胞的发育；
巨核细胞（MK），血小板的母体细胞。
于是，研究者用人工材料（丝织海绵）做成了包含上述条件的血小板造血3D仿生构造，看起来很像一个蚕茧中的生物工厂。
四、人造血小板的数量与效率——湍流的秘密
解决人造血小板的另一个关键问题是生产效率。实际上，人造红细胞正是因为效率源不能满足临床输注需求，离实际应用仍然遥远。人造血小板也始终面临这一难题。即使应用了上述的各种条件，如剪切应力、各种可溶性因子、细胞外基质及其硬度等，生物制备的血小板数量离实际临床应用的要求仍然存在很大差距。
临床上一个治疗量的单采血小板约含2-3×1011个血小板，也就是2000-3000亿个血小板。在人体生理造血过程中，骨髓造血干细胞产生的每个MK可生成超过2000个血小板，而在之前少数几个“大规模”制备人造血小板的研究中，每个iPSC平均可产生16个MK，而每个MK可产生约30个血小板。不难看出，iPSC制备血小板的效率远不如正常的人体骨髓造血。
在前人研究的基础上，Ito等开发了各种不同的微流体血小板生物发生器。他们发现，湍流可以刺激培养中的MK分泌一些可溶性因子，包括胰岛素因子结合蛋白2（IGFBP）、巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）和苯乙肼裂解酶（NRDC），这些因子促进体外培养中血小板的脱落，从而大大提高了体外血小板制备的数量。研究者依次使用0.3L、2.4L到8L容量的生物反应器，最终成功制备了1-1.3×1011个血小板，并且在体外和体内实验中都显示了类似于捐献血小板的正常功能。
这一研究首次将体外制备的血小板数量达到了实际临床应用水平，具有里程碑式的意义。正想本文开始所说，人造血小板终于可能从实验室走到病房。
五、前景美好——但挑战依然存在
iPSC制备血小板的研究成果显示了光明的应用前景，为人造血液的研究注射了一支强心针。或许在不久的将来，人造血液将大大缓解日趋紧张的血小板供应压力。
但是，挑战依然存在。
首先，与“天然”的捐献血小板相比，iPSC制备的血小板的大小、形态、活性和体外存活时间存在高度不均一性，尚不符合目前高度标准化的血小板制品管理及临床应用要求；
其次，iPSC制备血小板的整个过程需要26天，难以解决临床紧急用血需求；
最后，iPSC制备血小板的成本可能要远高于捐献血小板，这也是一个不容忽视的问题。
现阶段，为了满足临床病患的用血需求，最最重要的仍然是：
无偿献血，定期献血。
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