甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法的建立

文章来源：发布时间：2009年10月09日浏览量：次 字体： 大 中 小

甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法的建立

发布日期：2009-9-14   来源：转载

【摘要】  目的： 建立检测甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法. 方法： 采用双抗体异位点一步夹心法，以甲胎蛋白单克隆抗体作为固相包被，采用改良过碘酸钠法进行甲胎蛋白多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体；以金刚烷胺衍生物CSPD作为底物，优化CSPD与SapphireII发光体系；用国家标准品校定定量标准品，建立了人血清AFP的化学发光免疫定量分析法. 用该法检测800份正常人血清，确定正常值参考范围，将临床血清标本100份与bayer Acs: 180全自动发光体系统进行比较. 结果： 本方法的最低检出量为2.0 ng /mL，线性范围2.0~600.0 ng/mL,批内和批间的变异率分别为6.7%和7.7%，回收率在98.2%~102.5%之间. 与CEA(3 μg/mL)的交叉≤0.15%；与铁蛋白(10 μg /mL) ≤0.04%；与人血清白蛋白（200 g/L）≤2.5×10-8，与人血清丙球蛋白（100 g/L）≤2.0×10-8，与bayer Acs:180比较相关系数r=0.994（P<0.001）. 结论： 建立的甲胎蛋白化学发光免疫分析法可常规用于临床检测.

【关键词】  甲胎蛋白类；化学发光测定法；定量分析

　　Establishment of chemiluminescent immunoassay for determination of alphafetoprotein

　　FENG YanMing, MA JunFen, WU Biao, GUO LanYing, WU YongJun, LI ZhiTao,  WU YiMing

　　1Department of Labour Health and Occupational Public Health Institution,  Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China, 2SinoAmerican Biology Company, Luoyang, 471003, China

　　【Abstract】 AIM:  To establish a method of chemiluminescent immunoassay for determination of alpha fetoprotein(AFP) in human serum.  METHODS: The twosite enzyme immunoassay is based on the direct sandwich technique. A monoclonal antibody was bonded to the microplate for coating and the conjugation of alkaline phosphatase to another polyclonal antibody was performed by NaIO4 method. Chemiluminescent immunoassay was established by optimizing CSPD and SapphireII luminescent system. Sensitivity, linear scope, precision, interference and recovery for the method were evaluated. The reference range was defined by testing 800 serum samples from healthy subjects.The comparison for 100 serum samples from patients was assayed by the bayer Acs:180 Automated Immunoassay system. RESULTS: The detectable minimum was 2.0 ng/mL. The linear scope was from 2.0 to 600.0 ng/mL. Average inter and intraassay were 7.7% and 6.7%, respectively. The recoveries ranged from 98.2% to 102.5%. The crossreacting rate for CEA(3 μg/mL), Ferritin(10 μg /ml), HAS(200 g/L), IgG(100 g/L) were≤0.15%, 0.04%, 2.5×10-8 and 2.0×10-8, respectively. Compared with bayer Acs:180 Automated immunoassay system, the relative coefficient was 0.994（P<0.001）. CONCLUSION: A successful establishment of chemiluminescent immunoassay provides a way for clinical determination of AFP.

　　【Keywords】  alphafetoproteins; chemiluminescent  measurements; quanti tative analysis

　　引言

　　甲胎蛋白（AFP）为最常用的肿瘤标志物之一. 是目前最好的可实际用于早期诊断原发性肝癌的指标，可在症状出现前6~12 mo作出诊断. 其他一些转移性肝癌及肝外肿瘤如睾丸肿瘤， 卵巢肿瘤，胃癌，胰腺癌，结肠癌，支气管癌，肾癌，乳腺癌和白血病等血液中的AFP也可增高. AFP属糖蛋白，分子量70000，含糖40 g/L，正常人血清AFP含量在2~8 μg/L之间，AFP正常值一般低于25 μg/L;本文根据化学发光免疫分析法的原理建立并研制了甲胎蛋白化学发光定量测定试剂盒，现将结果报道如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　抗AFP单抗腹水购自OEM公司；AFP多克隆抗体为自制；AFP纯品抗原购自Fitzgeral公司；碱性磷酸酶（ALP）由华美生物工程公司提供；化学发光底物CSPD及增强剂购自PE公司；过碘酸钠（NaIO4）、硼氢化钠（NaBH4）、乙二醇、2，4二硝基氟苯（DNFB）均购自Sigma；Sephadex G200凝胶柱层析购自LKB公司，DE52离子交换柱购自Sigma，聚苯乙烯塑料白色不透明微孔板购自深圳金灿华；luminescent化学发光仪（芬兰雷勃）；洗板机（BioRad）；AFP国家标准品购自中国药品生物制品检定所.  标本均为血清，清亮无溶血，-20℃冻存. 分别为健康体检门诊的成年男性200份，成年女性（非妊娠女性）200份，青少年200份，老年人标本200份，其中男女比例为1∶1；临床标本100份是陕西省人民医院放免科采集的肿瘤或疑似患者血清.

　　1.2方法

　　1.2.1AFP单克隆抗体的纯化抗AFP单抗腹水用500 g/L的饱和硫酸铵沉淀，再溶解透析后DE52换柱纯化，分部收集,测定蛋白浓度. 蛋白浓度应在4~10 g/L之间，无菌过滤，加1 g/L NaN3后分装. -20℃存放.

　　1.2.2AFP多抗血清制备与纯化纯品AFP免疫健康雄性山羊，首次剂量0.5 mg/只. 4 wk后加强免疫,剂量减半，共加强免疫3次. 耳静脉采血测定效价，双扩散效价>1∶128的羊，进行心脏采血，分离血清，羊抗AFP血清按照1.3.1方法进行纯化.

　　1.2.3碱性磷酸酶标记抗体的制备采用改良过碘酸钠乙二醇法进行标记［1］，将获得的IgGALP用含100 g/L小牛血清的0.05 mol/L (pH 7.6)TBS缓冲液按1∶1000稀释成工作液，保存于-20℃.

　　1.2.4AFP校准品制备用系列国家标准品标定AFP纯品抗原后，用AFP校准品稀释液稀释成含量分别为0, 10, 25, 50, 15, 600 ng/mL系列浓度，用国家标准品做定量曲线进行校准品浓度测定、相关性分析,建立定量标准品.

　　1.2.5化学发光系统的优化［2-3］由SapphireII不同浓度的增强剂和CSPD组成底物工作液，进行化学发光值（RLU）测定，进行底物工作液的优化.

　　1.2.6固相化抗体微孔板的制备［4］将抗AFP单抗用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释成1.0, 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 μg/mL的包被浓度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含10 g/L酪蛋白的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)37℃封闭2 h后晾干备用，确定包被选择最佳包被抗体工作浓度.
 
　　1.2.7正常人参考血清的确定用优化好的AFP化学发光定量试剂对800份健康人标本进行浓度测定，进行统计学分析，计算x+2 S，确定正常血清参考范围.

　　1.2.8化学发光免疫检测样品或标准品于相应孔分别加25 μL后，每孔再各加抗AFPALP75 μL，在震荡器上混匀1 min，置37℃恒温反应60 min. 洗掉游离成分，加入底物工作液50 μL，ALP催化底物脱磷酸酯,并发出463 nm的可见光，第10 min后测定各加样品孔的发光值RLU，并将数据用化学发光检测仪定量软件Luminoskan Ascent version 2.4.1软件进行定量分析.

　　2结果

　　2.1底物工作液的优化CSPD浓度为0.8, 0.4, 0.2, 0.1 mmol/L，SapphireII浓度为2.0, 1.0, 0.5, 0.25 g/L，分别用碱性磷酸酶1∶1000, 1∶10000在5, 10 min进行化学发光测定，记录不同增强剂和CSPD浓度的发光值，分别做出CSPD浓度RLU的曲线和SapphireIIRLU的曲线（图1）.

　　分析上述数据可得出以下结论CSPD在0.4 mmol/L以下时，RLU随CSPD浓度的变化而成比例变化，在0.4 mmol/L时达到平台，可能是底物浓度在0.4 mmol/L时使酶达到饱和. 增强剂SapphireII浓度对RLU的变化较复杂，在0.5~1 g/L时达到最大RLU，以后随着增强剂浓度的增加RLU反而下降. 确定底物工作液配制的浓度为：0.4 mmol/L的CSPD，增强剂SapphireII浓度为1.0 g/L.
 
　　2.2包被抗体浓度和酶标记抗体浓度的确定根据不同包被抗体浓度测定定量标准品的发光值，分别做出不同浓度包被抗体RLU的曲线（图2）. 包被浓度低时试剂的整体发光值也低，随着包被浓度的升高发光值也相应升高，在5.0 μg/mL时，发光值达到一个平台期（此时灵敏度达到一个平台期），选择标准曲线接近于直线时的包被浓度（5 μg/mL）为最佳.

　　2.3最低检出量平行测定20孔零值校准品血清，计算零值校准品RLU平均值（x）及标准差(S)，以x+2 S为测定值代入标准曲线方程中，求出其对应的浓度值，所对应的浓度值即为最低检出量为2.0 ng/mL.
 
　　2.4特异性检测分别测定与CEA(3 μg /mL)、铁蛋白(10 μg /mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙种球蛋白(200 g/L)的交叉反应率，分别为≤0.15%, ≤0.04%, ≤2.5×10-8, ≤1.03×10-8.

　　2.5精密度测定AFP浓度为48.8~73.2 ng/mL的质控血清，重复检测3次,每次重复20孔，进行精密度测定，计算批内、批间平均变异系数分别为6.7%, 7.7%.

　　2.6正常人参考血清的确定对800份健康人血清检测进行统计，其中有95.4%的小于8.0 ng/mL,正常浓度只有上限而无下限，上限浓度去除5%的不可信区间，同时参考放免检测结果和目前公认的正常值范围，本检测方法的正常人血清应小于25 ng/mL.

　　2.7准确度取3份临床样本分别加入5 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL浓度的血清样品测试样品的加入回收率，对3份临床样本分别进行90%, 60%, 30%稀释计算稀释回收率，结果显示：加入平均回收率为98.6%，平均稀释回收率为102.3%.

　　2.8与进口试剂的比较［5］与bayer ACS: 180 全自动化学发光系统的AFP试剂共同对100份临床标本进行检测，二者所得的数值进行分析，其相关性有统计学意义（图3），LumiassayTM=1.2715×ACS: 180  -0.4126（n=100），（r=0.994, P<0.001）.

　　3讨论

　　甲胎蛋白（AFP）为最常用的肿瘤标志物之一，其定量检测的方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法,各具特点.
   
　　本研究建立的甲胎蛋白(AFP)化学发光免疫定量分析方法［6］，采用自行设计AFP多抗血清制备和纯化工艺，采用改良过碘酸钠乙二醇法对AFP多抗进行ALP标记，较传统的戊二醛交联法标记效率要高，灵敏度、特异性都较好；采用金刚烷衍生物及其增强剂作为发光底物系统［7］, 其酶解速度快，达到最大光信号时间短，且发光信号强、持续时间长，信噪比高，通过优化增强剂的浓度能使发光强度增强100~100 000倍；可测定浓度线性范围宽，样品无需稀释即可检测. 由于化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响，有很高的灵敏度，该方法最低检出量为2.0 ng/mL. 该方法克服了传统的放射免疫法带来的环境污染和健康危害；操作简单，检测自动化程度高，适用于全自动和半自动仪器.
　　本研究建立的方法敏感性、特异性、线性范围、精密度、回收率均能满足常规临床检测要求，其采用的是开放式反应系统，因此可与大多数的化学发光检测仪器配套使用，在临床推广应用.

【参考文献】
  　　
    ［1］巴德年. 当代免疫学技术与应用［M］. 北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:927-948.

　　［2］尹东光，贺佑丰，刘一兵,等. 几种主要化学发光物质的发光性能及其化学发光免疫分析体系［J］.标记免疫分析与临床,2002，9(4):225-229.

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　　［5］Josefina MB, Neus GR. Evaluation of Ciba Corning ACS: 180TM Automated Immunoassay System［J］.Clin Chem,1994，40(3):407-410.

　　［6］Lin J, Yan F, Hu X, et al. Chemiluminescent immunosensor for CA199 based on antigen immobilization on a crosslinked chitosan membrane［J］.Immunol Method, 2004,291(12):165-174.

　　［7］Dan Chen, Lawrence A. Kaplan. Performance of a newgeneration chemiluminescent assay for Hepatitis B surface antigen［J］. Clin Chem,2006, 52:1592-1598.